EVs 研究新手必讀：從樣品到結果的4個步驟
胞外囊泡 (Extracellular Vesicles, EVs) 因其具有作為生物標誌 (biomarker) 和治療工具 (therapeutic tools) 的巨大潛力而在生物學和醫學領域日益受到關注。然而，EVs 的異質性 (heterogeneity) 和複雜性也為新手帶來許多挑戰。
內容大綱
為什麼先看這一篇？
- 參考 MISEV2023 指引所撰寫，提供新手清晰、實用的指引。
- 這篇是「流程導航」，幫助你了解 EV 研究流程的基礎流程。
- 深入技術細節及詳情，請見專文：
什麼是胞外囊泡？外泌體？
胞外囊泡 (Extracellular Vesicles, EVs) 是指從細胞釋放、由脂雙層膜包裹 (delimited by a lipid bilayer) 且無自我複製能力 (replicate) 的顆粒。在早期研究中，將 EVs 依其生物起源 (biogenesis) 和尺寸 (size) 主要分為3大類：
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外泌體 (Exosomes) |
微囊泡 (Microvesicles) |
凋亡小體 (Apoptotic bodies) |
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| 尺寸 | 40 ~ 120 nm | 100 ~ 1000 nm | 1000 ~ 5000 nm |
| 生物起源 | 多囊體 (MVB)，透過內吞途徑 |
細胞膜，透過向外出芽 |
細胞膜，細胞凋亡過程 |
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標誌& 組成 |
Tetraspanin (CD9, CD63, CD81), Alix, Tsg101, flotillin-1 |
Selectins, Integrins |
DNA, histones, cell organelles, Nuclear fractions, Annexin V. |
然而，國際胞外囊泡學會 (ISEV) 在 MISEV2018 及 MISEV2023 建議：若無明確的生物起源證據，優先採用操作性命名，可依囊泡的物理特徵、表面標誌、細胞狀況或形態進行命名，如 sEV (小EVs)、lEV (大EVs) 及 CD63+ EV 等通用術語。
外泌體 (exosomes) 指源於胞內體系統 (endosomal system) 且經多囊體 (MVB) 釋放的 EVs；惟在實務上難以直接證明起源，故在缺乏證據時不建議泛用此術語。其常見報導尺寸約介於 40 ~ 120 nm間，常見標誌為四跨膜蛋白 (tetraspanins)，如 CD9、CD63、CD81 等。外泌體可攜帶其親代細胞 (parent cell) 的核酸 (DNA、RNA)、脂質和蛋白質等分子訊息，並傳遞至受體細胞 (recipient cell) 調控其功能，影響多種生理功能及疾病進程，具強大的治療潛力，故成為近年研究熱點。
EVs 研究流程
EVs 研究涉及多個關鍵步驟，包含樣品準備到最後的分析和儲存各步驟都會影響EVs的品質。
1. 樣品蒐集及前處理 (Collection and Pre-Processing)
目的：獲取含有 EVs 的原始生物材料，並儘早移除細胞及特定污染物。
材料：EVs 可從生物源獲取，如細胞培養液 (cell culture-conditioned medium)、細菌 (bacteria)、血液 (blood)、尿液 (urine) 、牛奶 (milk) 等。
通用建議：
• 請報告樣品來源、數量 (如體積、重量) 及採集的方法及儲存的所有細節。
• 從原始材料中儘早移除細胞，否則細胞破損可能形成類天然 EVs 的顆粒；細胞死亡及活化也可能會改變 EVs 的組成和功能。
• 建議在樣本儲存之前先完成必要的前處理，以去除可能的干擾物質，如細胞。
• 樣品儲存可能對 EVs 產生影響，請避免反覆凍融循環 (freeze‐thaw cycles)。
• 報告 EVs 分離前後的所有儲存條件，含防腐劑 (preservatives) 或冷凍劑 (cryoprotectants)、溫度、時間、冷凍程序、儲存容器、凍融循環次數和解凍方法。
* 本文僅列通用建議，針對各類樣品之個別建議，請查閱 MISEV2023
2. 純化與濃縮 (EV Separation and Concentration)
目的：從原始生物材料中分離 EVs、提高 EVs 濃度，同時盡可能減少非 EVs 成分 (如游離蛋白、脂蛋白、細胞碎片等) 的干擾。
純化方法：每種方法的回收率 (recovery) 及特異性 (specificity) 皆有所不同，應依據樣品的特性選擇不同的分離 (isolation) 或富集 (enrichment)方法，如差速離心法 (dUC)、密度梯度離心法 (DG, dgUC)、 超過濾法 (UF)、粒徑篩析層析法 (SEC)、沈澱法 (precipitation) 等。
通用建議：
• 依據 EVs 的來源特性、研究目的以及所需的 EVs 產率和特異性來決定分離方法。
• 需要更高純度的 EVs 時，可考慮串聯兩種以上不同原理的純化方法
• 大體積材料來源可能需要先濃縮再分離會更有效率，如 CCM、尿液、牛奶。
• 針對市售商業套組，應優先選擇公開分離原理及成分細節的套組。
• 所有 EV 分離方法皆建議提供純度與回收率佐證。
• 提供足夠的方法細節以利重現每個分離和濃縮步驟。
• 評估或建議新分離/濃縮方法時，請在每個步驟前/後對 EVs 進行測試，以估算其富集倍數 (fold enrichment) 及產量 (yield)。
延伸閱讀：如何使用切向流過濾純化外泌體？
3. 定量與表徵 (EV Characterization)
目的：確認分離的顆粒是否為 EVs，可對其大小、濃度、形態和生物標誌物進行分析，是驗證分離可靠性的關鍵步驟。
定量及表徵方法：EVs 表徵方法包含顆粒濃度、蛋白質含量、脂質含量、總 RNA 含量、EVs 形態、蛋白質組成等。
通用建議：
• EVs 表徵應至少包含三個層面的資訊：
(1) 特理與定量特性 (如顆粒濃度、粒徑分佈)，用以描述樣品的整體性質；
(2) EVs 標誌物 (如跨膜蛋白、GPI 錨定蛋白、胞質或細胞膜來源蛋白)，以確認樣品為 EVs；
(3) 非 EV 共分離成份 (non-EV proteins)，用以評估樣品純度並區分非 EV 來源的污染物。
• 沒有單一的測量方法能夠滿足所有表徵要求，建議使用偵測極限不同的正交法 (orthogonal methods) 進行測量。
• 報告所有分析方法的細節，包括儀器、參數和數據分析過程，以確保實驗的可重複性和透明度。
• 建議以生物源定義 EVs 的產量，如細胞的數量、生物體液體積、組織重量等。
• 應進行 EVs 的定量計算，如顆粒數量、蛋白質 (protein) 和/或脂質 (lipid) 含量。
• 應對 EVs 的通用成份或特定成份進行測試，尤其有特異性要求時，如 EVs 亞型 (EV subtypes)。
• 應根據希望達到的特異性對 EV 製劑進行測試，以確定是否存在與 EV 亞型或 EV 相關的成分。
• 需確定非囊泡 (non-vesicular)、共分離 (co-isolated) 成分的存在程度。
• 使用定量指標來表徵 EVs 時，提供儀器及方法檢測極限 (LOD)。
• 鼓勵使用標準品、陰性對照與多重檢測平台交叉驗證
延伸閱讀：從探索到驗證：為何需要「外泌體標準品」？
4. 儲存 (Storage)
目的：維持已分離 EVs 的完整性、功能和穩定性，以供後續實驗使用。不當的儲存會影響 EVs 的特性 (characteristics)，包括穩定性 (stability)、顆粒數量、聚集 (aggregation) 和功能 (function)。
通用建議：
• 報告 EVs 分離前後的所有儲存條件，含防腐劑 (preservatives) 或冷凍劑 (cryoprotectants)、溫度、時間、冷凍程序、儲存容器、凍融循環次數和解凍方法。
• 避免反覆凍融循環 (freeze-thaw cycles)，建議可分裝 (aliquoting) 使用。
• 建議快速冷凍及解凍樣品，以利最大限度地保留 EVs 的形態和功能。
新手地雷區
EVs 的複雜性常常讓新手陷入一些常見的陷阱
- 命名混淆：不加區分的使用外泌體 (exosomes) 一詞。除能證明其生物起源，否則應使用「胞外囊泡」(EVs) 以避免誤導性結論。
- 樣品污染：細胞培養的血清或補充劑常含有大量外源性 EVs 及其它因子。進行 EVs 相關實驗時，務必去除內含 EVs 或直接使用無血清培養液，減少 EV 污染的可能性。
- 細胞干擾：蒐集樣品後未能及時且徹底地移除細胞，死細胞或受損細胞則可能形成類天然 EVs 的顆粒、釋出胞內成份、改變 EVs 組成及功能，造成結果失真。
- 分離方法選擇不當：不同的分離方法有不同的回收率和純度及其優缺點。應根據樣品類型、實驗目的及後續應用，選擇能夠提供足夠純度和回收率的純化方法。
- 表徵不足：未充份表徵或未檢測常見污染物 (如脂蛋白lipoprotein)，不足以確認檢測物為 EVs 或導致實驗結論不可靠。建議採用多種方法進行全面的表徵。
- 儲存不當：反覆凍融、溫度或儲存容器都可能導致 EVs 的完整性、濃度和功能受損。務必嚴格遵循標準儲存流程並詳實記錄。
參考文獻
- Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches
- Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines
- Biological Functions Driven by mRNAs Carried by Extracellular Vesicles in Cancer
- Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research
常見問題 (FAQ)
Q1: 若沒有明確生物起源 (biogenesis pathways)，該怎麼命名分離的囊泡 (EVs)？
A1: 國際胞外囊泡學會 (ISEV) 建議在沒有明確的亞細胞起源證據前，使用通用術語「胞外囊泡 (EVs)」。而可以依其物理特性 (physical characteristics)、生化組成 (Biochemical composition)、細胞起源/情況 (cellular origin and/or conditions under which EVs were generated) 進行命名而避免混淆和不準確的使用。
Q2: 哪種分離方法可以確保分離出的 EVs 是純淨的？
A2: 沒有任何分離方法可以分離出「絕對純淨的 EVs 」。請依樣品類型、實驗目的及後續應用選擇最合適的分離技術。近年多篇研究建議以採用多種純化方法，以優勢互補得到高產率及高純度的組合。
Q3: 如何確認分離出的真的是 EVs？
A3: 請以多方法組合確認：(1) 物理特性（顆粒濃度、粒徑）、(2) EVs 標誌（跨膜/GPI蛋白）、(3) 負性標誌（非 EV 共分離物，以評估純度）。單一指標不足以確認為 EV。
